96通道核酸提取儀憑借高通量（單次處理96份樣本，耗時30-60分鐘）、自動化優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于法醫(yī)檢測、臨床診斷等場景。陳舊血跡（存放超3個月或經(jīng)反復(fù)凍融）因DNA被核酸酶降解、環(huán)境氧化斷裂，易導(dǎo)致提取量不足、片段完整性差，需通過“樣本預(yù)處理-試劑優(yōu)化-程序調(diào)整-防污染”協(xié)同方案，較大化回收降解核酸，保障后續(xù)檢測（如PCR）有效性。

　　一、樣本預(yù)處理：抑制核酸酶活性，保護(hù)降解DNA

　　針對陳舊血跡中殘留的核酸酶與雜質(zhì)，預(yù)處理階段需優(yōu)先阻斷降解、純化樣本：

　　核酸酶抑制劑添加：將陳舊血跡樣本（如血斑、血涂片）溶于裂解緩沖液時，同步加入EDTA（終濃度20-50mM）與RNase抑制劑（如40U/mL的RNase Out），EDTA螯合Mg²?（核酸酶活性必需離子），抑制劑阻斷RNase對RNA的降解；若為嚴(yán)重降解樣本（如存放超1年），可額外添加蛋白酶K（終濃度20μg/mL），37℃溫浴10分鐘，降解樣本中殘留的蛋白質(zhì)（含核酸酶），減少DNA斷裂。

　　樣本純化與濃縮：對稀釋后的陳舊血跡樣本，先用0.22μm濾膜過濾去除細(xì)胞碎片、纖維蛋白等雜質(zhì)（避免堵塞提取儀吸附柱），再通過離心濃縮（12000rpm×5分鐘）或核酸吸附磁珠預(yù)結(jié)合（提前孵育10分鐘），提升降解DNA的富集效率，避免微量降解片段在后續(xù)步驟中流失。

　　二、提取試劑優(yōu)化：適配降解核酸的結(jié)合與洗脫

　　通過調(diào)整試劑成分，增強(qiáng)對短片段降解DNA的捕獲能力：

　　磁珠與緩沖液改良：選用超順磁性納米磁珠（粒徑100-200nm，比表面積≥50m²/g），其表面修飾的羧基或硅羥基密度更高，可高效結(jié)合短至50bp的降解DNA片段（傳統(tǒng)磁珠對＜200bp片段結(jié)合率低）；調(diào)整結(jié)合緩沖液pH至5.5-6.0（酸性環(huán)境促進(jìn)DNA與磁珠結(jié)合），并提高鹽濃度（如GuSCN終濃度4M），增強(qiáng)對降解片段的吸附穩(wěn)定性。

　　洗脫條件調(diào)整：采用低離子強(qiáng)度洗脫液（如10mM Tris-HCl，pH8.0），并延長洗脫時間（從常規(guī)1分鐘增至3分鐘），同時控制洗脫溫度為55℃（溫和加熱促進(jìn)降解DNA從磁珠表面分離，避免高溫導(dǎo)致片段進(jìn)一步斷裂），確保洗脫效率提升30%以上，減少降解片段殘留。
 

　　三、提取程序適配：優(yōu)化96通道的自動化流程

　　針對降解樣本特性，調(diào)整儀器提取程序參數(shù)，平衡效率與回收率：

　　裂解與結(jié)合步驟優(yōu)化：延長裂解時間（從常規(guī)5分鐘增至8分鐘），并設(shè)置2次振蕩（3000rpm×30秒），確保陳舊血跡樣本充分裂解，釋放更多降解DNA；結(jié)合階段采用“慢速混勻+多次孵育”模式（每孵育3分鐘混勻1次，共3次），避免高速振蕩導(dǎo)致降解片段斷裂，同時提升磁珠與DNA的結(jié)合均勻性（96通道間差異≤5%）。

　　洗滌與干燥控制：減少洗滌次數(shù)（從常規(guī)3次減至2次），避免過度洗滌導(dǎo)致短片段DNA流失；干燥步驟縮短加熱時間（從5分鐘減至3分鐘），控制干燥溫度為60℃（避免高溫使磁珠孔徑收縮，導(dǎo)致降解DNA無法洗脫），確保96個通道的洗脫效率一致性。

　　四、防污染與質(zhì)量控制：保障提取結(jié)果可靠性

　　降解DNA含量低，需嚴(yán)格控制污染，同時驗(yàn)證提取效果：

　　防交叉污染措施：96通道核酸提取儀需啟用紫外線消毒功能（每次實(shí)驗(yàn)前后照射30分鐘），并在樣本孔間加裝物理隔離板，避免氣溶膠交叉污染；使用無酶耗材（如無RNase離心管、濾芯吸頭），并在試劑配制與樣本處理時佩戴無菌手套，防止外源性核酸酶引入導(dǎo)致降解加劇。

　　提取后質(zhì)量檢測：對提取產(chǎn)物用微量紫外分光光度計（如Nanodrop）檢測濃度（目標(biāo)≥10ng/μL）與純度（A260/A280=1.8-2.0），同時通過瓊脂糖凝膠電泳（2%膠）驗(yàn)證降解片段完整性（確認(rèn)主要片段分布在50-500bp）；對96份樣本隨機(jī)抽取10份進(jìn)行PCR擴(kuò)增（如針對100bp短片段引物），確保擴(kuò)增成功率≥90%，驗(yàn)證提取效果。

　　通過以上方案，96通道核酸提取儀可有效解決陳舊血跡的降解問題，降解DNA回收率提升至70%以上，同時保持高通量優(yōu)勢，適配法醫(yī)鑒定中批量陳舊血跡樣本的高效處理需求，為后續(xù)基因分型、病原體檢測等提供可靠的核酸模板。